許林杰1,2, 劉徽1, 任玲1, 楊柯,1

Ni-Ti合金以其獨特的形狀記憶效應[1]和超彈性[2]廣泛用作自膨式介入支架材料，如血管支架[3]、尿路支架[4]、腸道支架[5]、下肢動脈支架[6]等。但是，當支架植入人體內血管后，仍有15%~20%的患者會發生不同程度的支架內再狹窄問題[7]，這可能會直接導致支架植入手術的失敗。此外，在生理環境中，由于體液腐蝕導致的Ni-Ti合金支架中的Ni2+釋放，還可能會造成一定的毒性反應[8]。研究表明，支架內再狹窄可通過支架表面的促內皮化[9]和抗凝血[10,11]處理來解決，Ni2+潛在的毒性危害也可通過進一步提高合金的耐蝕性能得到改善[8]。

有研究表明，采用等離子沉積[12]、水熱處理[13]等表面改性方法在Ni-Ti合金表面構建功能性涂層，可以促進支架表面的內皮化，以抑制發生支架內再狹窄，同時還能夠提高Ni-Ti合金的耐腐蝕性能，減少Ni2+的釋放。例如，Yang等[12]采用等離子沉積技術在Ni-Ti合金表面沉積TiN涂層，改善了內皮細胞功能，對Ni2+釋放有一定阻止作用。Zhao等[13]通過水熱處理法在Ni-Ti合金表面構建TiO2與Ti4Ni2O組成的納米紡錘體，增強了內皮細胞的遷移能力，在促進內皮細胞功能表達的同時，減少了Ni2+的釋放。然而，這些涂層往往存在與合金基體材料的結合力差，因而在支架使用過程中易發生剝落等問題[14,15]。因此，發展自身具有抑制支架內再狹窄功能并進一步提高耐蝕性能的新型Ni-Ti合金具有重要的臨床應用價值。

Cu作為一種金屬中常見的合金元素，同時還具有促血管內皮化、抗凝血、促成骨等多重生物功能。大量研究已經證實，包括316L-Cu不銹鋼[16]、L605-Cu鈷基合金[17]在內的含Cu金屬材料均具有優異的促內皮化與抗凝血性能，并在動物體內表現出顯著的抑制支架內再狹窄功能。因此，在現有Ni-Ti合金中適量添加Cu，有望賦予材料自身促內皮化與抗凝血功能。此外，已有研究[18~23]表明，Ni-Ti-Cu合金不僅具有良好的超彈性，而且還能保持良好的細胞相容性與抗菌性能[24]，這使Ni-Ti-Cu合金具有臨床應用的巨大潛力。

然而，對于Cu元素的加入是否有利于提高Ni-Ti合金的耐蝕性能，目前還存在爭議[24~30]。例如，Li等[24]的研究結果是Ni-Ti-Cu合金的耐蝕性能優于Ni-Ti合金；而Cheng等[26]的結果則是Cu的加入降低了Ni-Ti合金的耐蝕性能，但Cu會提高Ni-Ti合金的再鈍化能力。基于上述分析，將Cu加入到Ni-Ti合金中有望發展出具有抑制支架內再狹窄功能且耐蝕性能較高的新型血管支架材料。

本工作基于合金化策略，在醫用Ni-Ti合金成分的基礎上制備了Ni-Ti-Cu合金，并以商用Ni-Ti合金作為對照組，采用電化學實驗分析添加Cu對Ni-Ti合金在模擬人體血液中腐蝕行為的影響。通過細胞增殖實驗、劃痕實驗、Transwell實驗及小管生成實驗，系統研究了Ni-Ti-Cu合金對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)分化的促進作用。此外，還采用動態凝血實驗，進一步評估了Ni-Ti-Cu合金的抗凝血性能。旨在全面展示Ni-Ti-Cu合金的抑制支架內再狹窄功能及耐蝕性能，為新型含銅Ni-Ti合金血管支架材料的開發提供科學依據。

1 實驗方法

1.1 材料制備

采用真空感應爐分別制備Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金，合金的化學成分分別為：50.48Ni-49.52Ti和42.79Ni-50.92Ti-6.29Cu (原子分數，%)。合金在真空熔煉爐中反復熔煉6次而成，以保證合金成分的均勻性。熔煉后的合金錠在1000℃均勻化退火12 h，并在850℃進行熱鍛，再冷拔為直徑7 mm的圓棒，最后切割成1 mm厚的圓片。所有樣品在實驗前均用SiC砂紙逐級打磨至2000#，用去離子水沖洗后，再用酒精清洗，干燥后得到實驗用樣品。

1.2 顯微組織與相組成表征

通過SSX-550掃描電子顯微鏡(SEM)觀察Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金的微觀形貌，工作電壓為20 kV。采用D/max 2500 X射線衍射儀(XRD)分析Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金顯微組織中的相組成，輻射源為Cu靶Kα 射線，工作電壓為40 kV，電流為40 mA，掃描速率為10°/min。用Jade 6.0軟件對XRD數據進行相組成分析。

1.3 表面自由能測試

采用JC-2000C型靜滴接觸角測量儀對樣品的表面自由能進行測試。利用微量進樣器將去離子水、甘油(C3H8O3)、溴代萘(C10H7Br)緩緩滴于樣品表面，當液滴與樣品表面接觸后，立即采集圖像并計算樣品的接觸角(θ)，基于OWRK/Fowkes方法計算樣品的表面自由能。表面自由能按照Young-Dupre方程進行計算[31]：

表面自由能由極性分量與色散分量組成：

式中，γsv、γlv分別為固-氣界面與液-氣界面的表面自由能，${?}_{\mathrm{s}\mathrm{v}}^{\mathrm{p}}$、${?}_{\mathrm{s}\mathrm{v}}^{\mathrm{d}}$與${?}_{\mathrm{l}\mathrm{v}}^{\mathrm{p}}$、${?}_{\mathrm{l}\mathrm{v}}^{\mathrm{d}}$分別為γsv和γlv的極性分量與色散分量。

1.4 電化學實驗

電化學實驗在Reference 600TM上完成，電解質溶液采用模擬人體血液[32]。首先進行開路電位(OCP)測試，之后進行電化學阻抗譜(EIS)測試，從105 Hz下降到10-2 Hz。EIS測試結束后，以0.5 mV/s的掃描速率進行動電位測量，范圍為-0.5~2.0 V。使用Gamry Echem Analyst軟件分析測試結果，以獲得腐蝕電位(Ecorr)、腐蝕電流密度(icorr)和點蝕電位(Epit)。利用ZsimDemo軟件對EIS進行電路擬合，以獲得電路圖中元器件參數。所有測試至少重復3次，以確保結果的可重復性。

1.5 體外生物學實驗

1.5.1 細胞培養

使用HUVECs作為模型細胞，在含抗生素(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)和10%胎牛血清的RPMI.1640培養基中于37℃、5%CO2 (體積分數)飽和濕度條件下進行培養。當細胞生長至趨近融合時，使用胰蛋白酶消化，收集細胞并調整細胞濃度至2 × 104 cell/mL，于無菌條件下在樣品表面接種細胞進行培養。

1.5.2 浸提液制備

樣品經121℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，于無菌條件下制備浸提液。以1.25 cm2/mL的浸提比例將樣品浸泡于RPMI.1640培養基中，在37℃浸泡72 h后，取出準備好的浸提液即刻進行實驗。

1.5.3 細胞增殖實驗

將Ni-Ti合金與Ni-Ti-Cu合金樣品分別置于48孔板中，設置4個平行樣。每孔加入1 × 104個細胞，在37℃、5%CO2條件下分別培養1和3 d。培養結束后，棄去培養板內培養基，加入300 μL含10% CCK-8試劑的培養基，再在37℃、5%CO2條件下培養2 h。取出樣品，在Multidkan GO酶標儀上測量450 nm波長處各孔的吸光度(optical density，OD)。

1.5.4 劃痕實驗

在孔板背面繪制平行線，保證每孔有3條直線穿過。每孔加入5 × 104個細胞，在37℃、5%CO2條件下培養至鋪滿孔底90%面積。用200 μL槍頭垂直于上述平行線輕輕繪制垂線，隨后經磷酸鹽緩沖溶液(PBS)緩慢沖洗后，加入1 mL無血清的浸提液。在加入浸提液0和24 h后，對同一位置進行拍攝。使用Photoshop軟件計算前后2個時間點照片中的劃痕區域面積，計算相對遷移面積比率。

1.5.5 Transwell實驗

利用Transwell實驗可以研究不同材料浸提液對內皮細胞個體遷移能力的影響。實驗前，內皮細胞于無血清培養液中饑餓培養24 h。向Transwell上室每孔加入2 × 104個細胞，下室加入600 μL含20%血清的樣品浸提液，于37℃、5%CO2下培養24 h。培養結束后，取出Transwell小室，棄去孔中的培養液，用棉簽輕輕擦掉上層遷移的細胞，經PBS清洗2次后，在4%多聚甲醛固定30 min。將小室適當風干后，使用0.1%結晶紫染色20 min，經PBS清洗3次后，在FV10-ASW激光共聚焦熒光顯微鏡下隨機挑選5個視野進行拍照并記數。

1.5.6 小管生成實驗

將Matrigel基質膠置于4℃溶解，向96孔板中每孔加入50 μL基質膠，于37℃細胞培養箱中孵育30 min進行固化。將內皮細胞消化后，每孔加入100 μL濃度為5 × 105 cell/mL的細胞懸液，并加入100 μL含10%血清的浸提液，于37℃、5%CO2下培養3 h生成小管。在顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察拍攝。使用Wimasis Wim Tube軟件定量分析小管長度和節點數。

1.5.7 動態凝血實驗

采用動態凝血實驗評價樣品的抗凝血性能。將100 μL抗凝人血滴加到實驗樣品表面，加入10 μL濃度為0.2 mol/L的CaCl2溶液，啟動凝血。分別計時10、30、50、70、90 min后，用2 mL去離子水緩慢流注于樣品表面，并輕輕混勻。隨后，吸取100 μL的流注液于96孔板中，使用酶標儀在545 nm波長處測量流注液的OD，并繪制動態凝血時間曲線，分析樣品表面的血液凝固情況。

1.6 統計學分析

實驗數據采用平均值和標準差來表示，每種材料測試3個以上的樣品。采用SPSS 13.0軟件和GraphPad Prism軟件對數據進行統計學分析以得到方差p，p < 0.05時表示數據具有顯著性差異，p < 0.01時表明數據差異性極顯著。

2 實驗結果與討論

Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的XRD譜如圖1a所示。可以看出，Cu的加入使Ni-Ti合金中的B2奧氏體相與Ni4Ti3相轉變為B19'單斜馬氏體相、B19正交馬氏體相以及CuNi2Ti相。表明添加Cu提高了Ni-Ti合金的馬氏體相變起始溫度(Ms)，這與Ni-Ti合金中的Ni被加入的Cu所取代有關[24]。Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金的SEM像如圖1b和c所示。由圖可見，Ni-Ti合金為等軸的奧氏體晶粒組織(圖1b)，Ni-Ti-Cu合金的晶粒內部分布著細板條狀的馬氏體(圖1c)，可見Cu的加入直接導致Ni-Ti-Cu合金的顯微組織發生了改變。

圖1

圖1   Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的XRD譜與SEM像

Fig.1   XRD spectra (a) and SEM images of Ni-Ti (b) and Ni-Ti-Cu (c) alloys

植入材料的表面潤濕性及其他表面特征(如表面形貌、表面電荷、表面官能團等)，對材料與人體組織之間界面上發生的一系列生物學反應具有重要影響，包括蛋白質吸附、與軟組織的相互作用以及細菌生物膜的形成[33]。因此，測試了Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金與不同液體的接觸角，并基于OWRK/Fowkes方法計算出表面自由能，結果如表1所示。可見，Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金與3種液體的接觸角均小于90°，都是親水性表面。Ni-Ti-Cu合金具有更低的極性力分量與色散力分量，因此具有更低的總表面自由能。有研究[34]表明，具有超親水表面與超疏水表面的材料都具有良好的血液相容性。Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金均為一般的親水性表面，因此應該具有相近的血液相容性，但具有較低表面自由能的材料更易于獲得優異的抗凝血性能[35]。

表1   不同樣品與去離子水、甘油和溴代萘的接觸角及表面自由能測量結果

Table 1  Measurement results of contact angle and surface free energy of different samples with deionized water, glycerin, and bromonaphthalene

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通過電化學實驗探究Ni-Ti-Cu合金在模擬人體血液中的耐蝕性能。圖2a中的OCP測試結果表明，Ni-Ti-Cu合金較Ni-Ti合金具有更高的開路電位(Eocp)，表明Ni-Ti-Cu合金在熱力學上發生腐蝕的傾向較低。圖2b的動電位極化曲線結果表明，Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金均發生了點蝕，且均表現出活化-鈍化-過鈍化的特征。Ecorr、icorr和Epit的測試結果如表2所示?？梢?，Ni-Ti-Cu合金的Ecorr與Epit均高于Ni-Ti合金，icorr低于Ni-Ti合金，表明在動力學上，Ni-Ti-Cu合金耐局部腐蝕與均勻腐蝕的能力均優于Ni-Ti合金，這可能是由于Ni-Ti-Cu合金表面上形成了更為致密的鈍化膜[36]。隨后，對2種合金進行EIS測試，結果如圖2c和d所示。對EIS結果進行擬合，擬合電路圖和參數示于圖2c插圖和表2中，擬合電路圖中的Rs、Qc1和Rc1分別表示溶液電阻、常相位角元件和鈍化膜電阻。結果表明，Ni-Ti與Ni-Ti-Cu合金的Nyquist圖(圖2c)在整個測試頻率范圍內(105~10-2 Hz)均表現為單一的容抗弧，表明2者均為具有單個時間常數的典型電容行為。這可以通過Bode圖(圖2d)驗證，其中2種合金的相位角在寬頻率范圍內(102~10-1 Hz)均接近90°。此外，Ni-Ti-Cu合金的阻抗弧半徑大于Ni-Ti合金，2種合金的Rs與Qc1相近，但Ni-Ti-Cu合金的Rc1較Ni-Ti合金高出1個數量級，表明Ni-Ti-Cu合金的鈍化膜具有更加優異的保護能力。以上電化學實驗結果表明，Ni-Ti-Cu合金在模擬人體血液中的耐蝕性能要優于Ni-Ti合金。由此可見，Cu的添加提高了Ni-Ti-Cu合金的耐蝕能力。

圖2

圖2   Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的電化學測試結果

Fig.2   Electrochemical test results of Ni-Ti and Ni-Ti-Cu alloys

(a) open circuit potential curves (Eocp—open circuit potential)

(b) potentiodynamic polarization curves (i—current density, E—potential)

(c) Nyquist diagram and fitting circuit diagram (Inset shows the equivalent circuit diagram. Z'—real impedance, Z''—imaginary impedance, R.E.—reference electrode, W.E.—working electrode, Rs—solution resistance, Rc1—passive film resistance, Qc1—constant-phase element)

(d) Bode diagram (|Z|—impedance modulus)

表2   從動電位極化曲線與EIS圖中獲得的電化學參數

Table 2  Electrochemical parameters obtained from polarization curves of driven potential and EIS diagram

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Brice$\tilde{\mathrm{n}}$o等[37]的研究表明，Ni-Ti合金中的馬氏體相占比越多，奧氏體相占比越少，其耐蝕性能越好，因而會釋放更少的Ni2+。本工作的實驗結果也證實，Cu的添加會使Ni-Ti-Cu合金的Ms點升高，這會導致合金中的奧氏體相更易于轉變為馬氏體相。XRD譜分析結果也表明，Cu的添加促進Ni-Ti合金由奧氏體相轉變為馬氏體相，并且Ni-Ti-Cu合金的耐蝕能力較Ni-Ti合金也得到了提高。此外，Marattukalam等[38]的研究表明，具有低的表面自由能的Ni-Ti-Cu合金，其腐蝕電位會向更高的方向移動，腐蝕電流密度也會降低，因而低表面自由能為Ni-Ti-Cu合金提供了更好的腐蝕保護。本工作也證實，相比于Ni-Ti合金，Ni-Ti-Cu合金具有更低的表面自由能，因而其耐蝕能力同樣得到了提高。

此外，還研究了Ni-Ti-Cu合金對HUVECs的作用，從而評價其是否具有促血管內皮化功能。利用細胞增殖實驗評估了Ni-Ti合金中添加Cu對HUVECs增殖的影響。實驗結果表明，隨著培養時間的延長，Ni-Ti合金的OD由1 d的1.40增加至3 d的2.27，相對增長率62.14%。Ni-Ti-Cu合金的OD由1 d的1.45增加至3 d的2.53，相對增長率74.48%，所有樣品表面上的細胞數目均出現增長，Ni-Ti-Cu合金樣品表面的增長更為明顯。由此可見，與Ni-Ti合金相比，Ni-Ti-Cu合金促進內皮細胞增殖的作用更強，并且無細胞毒性。

隨后，本工作進一步研究Ni-Ti-Cu合金浸提液對內皮細胞遷移能力的影響。通過劃痕實驗評價不同樣品浸提液對單層細胞長滿后的橫向遷移的影響，即對細胞群體運動的影響。采用Transwell實驗分析不同樣品浸提液對單個細胞遷移能力的影響。圖3a1、a2、b1、b2給出了劃痕實驗與Transwell實驗的結果。如圖3a1和a2所示，與不同樣品浸提液培養后，內皮細胞均遷移至劃痕位置之間的空白區域，見圖中黑色線所示。內皮細胞的相對遷移面積比率統計結果表明，Ni-Ti合金的相對遷移面積比率為25.83%，Ni-Ti-Cu合金的相對面積遷移比率為34.51%，Ni-Ti-Cu合金浸提液促進了內皮細胞的橫向遷移。圖3b1和b2的結果顯示，Ni-Ti合金浸提液向下室遷移的內皮細胞數目約為35，而Ni-Ti-Cu合金則約為69。因此與Ni-Ti合金相比，內皮細胞與Ni-Ti-Cu合金浸提液共培養后，向Transwell下室遷移的細胞數目明顯增多。劃痕實驗與Transwell實驗結果均表明，Cu在Ni-Ti合金中的添加顯著增大了內皮細胞的遷移能力。

圖3

圖3   Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的體外細胞實驗結果

Fig.3   In vitro cell test results of Ni-Ti (a1-c1) and Ni-Ti-Cu (a2-c2) alloys

(a1, a2) scratch (b1, b2) Transwell (c1, c2) tube formation

血管支架植入人體后，血管的快速修復能夠減少新生內膜的生成和血小板吸附，進而會降低血栓及支架內再狹窄發生率。因此本工作還研究了Cu的添加對Ni-Ti合金的血管生成能力的影響。由于內皮細胞在基質膠中可以形成類似管腔的結構，因此采用小管生成實驗，研究不同材料浸提液對內皮細胞成血管能力的影響，實驗結果如圖3c1和c2所示。可見，與Ni-Ti合金相比，Ni-Ti-Cu合金浸提液能促進內皮細胞的小管形成。統計結果顯示，與Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金浸提液共培養后的內皮細胞形成的毛細血管狀結構的節點數分別為134和156，血管長度分別為22.74和25.79 mm。與Ni-Ti-Cu合金浸提液共培養后的內皮細胞形成的毛細血管狀結構的節點數及血管長度均明顯增多，表明Ni-Ti-Cu合金能夠加速內皮細胞形成網絡結構。

動態凝血實驗可以用來評估材料的抗凝血能力。圖4為Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的動態凝血實驗結果?？梢娫谙嗤哪獣r間內，Ni-Ti-Cu合金稀釋液的OD更高，說明血液中的血紅蛋白更多，即材料表面上凝固的血液更少。進一步對OD與時間進行線性擬合，結果表明，Ni-Ti合金的凝血時間為61.78 min，而Ni-Ti-Cu合金的凝血時間則延長至79.06 min，相比Ni-Ti合金增加近30%，說明Ni-Ti-Cu合金能夠顯著降低血液凝固速率，具有更優的抗凝血能力。

圖4

圖4   Ni-Ti和Ni-Ti-Cu合金的動態凝血實驗結果

Fig.4   Results of dynamic coagulation experiment of Ni-Ti and Ni-Ti-Cu alloys (y—fitted value of absorbance of residual free hemoglobin in streamer solution measured at 545 nm wavelength, x—dynamic coagulation time, R2—fitting correlation coefficient)

以上實驗結果表明，Ni-Ti-Cu合金較Ni-Ti合金具有更為優異的促進血管內皮化功能，這與Cu的添加密切相關。已有研究[39,40]表明，Cu可以提高心肌血管中的內皮生長因子(VEGF)水平，因而會促進內皮細胞的增殖與遷移。本工作研究結果證實，在Ni-Ti合金中添加適量Cu可促進HUVECs的增殖和遷移。動態凝血實驗結果表明，Ni-Ti-Cu合金的抗凝血能力也優于Ni-Ti合金。這是因為表面自由能較低的表面對血液中某些成分的吸附能力減弱，因此會表現出更優的抗凝血性能[41]。表面能測試結果證明，Cu的添加使Ni-Ti合金的表面自由能下降，由此可見，Ni-Ti-Cu合金具有更為優異的抗凝血作用，因而更有利于降低血栓的發生率。

3 結論

(1) 與Ni-Ti合金相比，Ni-Ti-Cu合金的Ms點提高，使其顯微組織由等軸奧氏體晶粒組織向細板條馬氏體組織轉變。此外，由于添加Cu，Ni-Ti-Cu合金的表面自由能下降。

(2) 在顯微組織變化和較低的表面自由能的共同作用下，與Ni-Ti合金相比，Ni-Ti-Cu合金的耐局部腐蝕與均勻腐蝕能力均得到提高。

(3) Ni-Ti-Cu合金具有更優的促進人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和成血管的能力，因而促內皮化作用更強。與Ni-Ti合金相比，Ni-Ti-Cu合金顯著降低血液凝固速率，具有更優的抗凝血能力。